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    本發明是一種預測對胃癌患者使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法的治療效果之方法，其包含有下述步驟(1)~(3)：(1)測定在由採取自該患者所採取之活體試料中所含有之EGFR的之表現量的步驟；(2)將由上述步驟(1)所得到之EGFR表現量與預先設定之對應切斷點(cut off point)相比較之步驟；以及(3)預測步驟，其係針對上述步驟(2)之比較結果，進行預測步驟，若EGFR之表現量比該切斷點更高時，即預測：對該患者選擇併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法會上顯示出充分治療效果的可能性高；而若EGFR之表現量在該切斷點以下時，則預測：對該患者選擇單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    公开号:TW201300109A
    申请号:TW101117340
    申请日:2012-05-16
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Takashi Kobunai；Hitoshi Saito；Teiji Takechi
    申请人:Taiho Pharmaceutical Co Ltd；
    IPC主号:A61K39-00
    专利说明:
    對胃癌患者選擇由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑所構成之化學療法的方法 發明領域
    本發明係關於：一種針對至少要使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法預測治療效果的方法；一種抗腫瘤劑，其用以投藥予已預測使用該複合劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高的患者；一種胃癌的治療方法；以及，一種抗腫瘤劑的用途。 發明背景
    針對進行性胃癌的化學療法，在臨床上應用的有5-氟尿嘧啶(5-Flurouracil)、順鉑(Cisplatin)、伊立替康(Irinotecan)、多西他賽(Docetaxel)、替加氟-尿嘧啶(商品名：UFT(註冊商標))、替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑(商品名：TS-1(註冊商標)；以下，有時將替加氟、吉美嘧啶、奧替拉西以莫耳比1：0.4：1複合而成的製劑稱為TS-1)等之抗腫瘤劑。
    另一方面，就為了防止胃癌腫瘤組織切除後之再發及/或轉移為目的而施行的胃癌術後輔助化學療法而言，藉由收集了超過1000名受試者的第三期臨床試驗ACTS-GC之研究，得知投與TS-1組與單獨使用手術組相較下，無論是整體存活期(overall survival)或無再發存活期的任一者，皆得以具統計意義地延長存活期間，且亦因沒有安全性的問題，目前在日本被認定為標準治療(非專利文獻1)。
    如上所述，雖然針對胃癌的術後輔助化學療法正積極地開發中，對於現狀的治療效果並不滿意。此外，由於患者的遺傳是影響術後輔助化學療法是否奏效的重大要因，所以實際上不試著投與抗腫瘤劑無法得知療效是問題所在。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
    [非專利文獻1] N Engl J Med. 2007; 357(18):1810~20. 發明概要

    本發明的目的為針對胃癌患者提供強力延命效果，且副作用少的化學療法。
    本案發明人利用針對胃癌患者之化學療法的反覆研究的結果，發現可將表皮成長因子受體(epidermal growth factor receptor，以下稱為EGFR)的表現量作為指標，藉此來判斷是否應該對替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑進一步併用EGFR抑制劑，而終至完成本發明。另，雖有報告指出EGFR與替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之療效相關(例如，Oncology 2008；74(1~2)：76~83)，但欲使替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑再與EGFR抑制劑併用時，可以EGFR表現量作為指標一事卻不為人知。
    亦即，本發明如以下所述：
    1.一種預測對胃癌患者使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法的治療效果之方法，其包含有下述步驟(1)~(3)：(1)測定在由採取自該患者所採取之活體試料中所含有之EGFR的之表現量的步驟；(2)將由上述步驟(1)所得到之EGFR表現量與預先設定之對應切斷點(cut off point)相比較之步驟；以及(3)預測步驟，其係針對上述步驟(2)之比較結果，進行預測步驟，若EGFR之表現量是比該切斷點更為高時，即預測：對該患者選擇併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高；而若EGFR之表現量在該切斷點以下時，則預測：對該患者選擇單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    2.如第1項之方法，其中替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之各有效成分的莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1。
    3.如第1或2項之方法，其中EGFR抑制劑為西妥昔單抗(Cetuximab)。
    4.如第1至3項中任一項之方法，其中化學療法為術後輔補助化學療法。
    5.一種抗腫瘤劑，係由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑所構成者，其用於治療胃癌患者，且該胃癌患者已在如第1至4項中任一項之方法中被預測：併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    6.如第5項之抗腫瘤劑，其中替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之各有效成分的莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1。
    7.如第5或6項之抗腫瘤劑，其中EGFR抑制劑為西妥昔單抗(Cetuximab)。
    8.一種抗腫瘤劑，係由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑所構成者，其用於治療胃癌患者，且該患者已在如第1至4項中任一項之方法中被預測：單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    9.如第8項之抗腫瘤劑，其中替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之各有效成分的莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1。
    10.一種胃癌之治療方法，其特徵在於，對於胃癌患者實施併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法，且該患者已利用如第1至4項中任一項之方法而被預測：併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    11.一種胃癌之治療方法，其特徵在於，對於胃癌患者實施單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法，且該患者已利用如第1至4項中任一項之方法而被預測：單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    12.一種由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑所構成之抗腫瘤劑的用途，係用於對胃癌患者實施該併用化學療法，且該患者已利用如第1至4項中任一項之方法而被預測：選擇該併用化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    13.一種由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑所構成之抗腫瘤劑之使的用途，係用於對胃癌患者實施單獨化學療法，且該患者已利用如第1至4項中任一項之方法而被預測：選擇該單獨化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    本發明的預測方法使胃癌患者選擇延命效果較高的化學療法成為可能。意即，就胃癌而言，對於使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑單劑之化學療法延命效果相對較低的患者，可提供具有較強延命效果的替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑併用之化學療法。
    此外，對於單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法比併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑顯示出更高治療效果的胃癌患者而言，由於可以省下不必要的EGFR抑制劑，在可減輕患者負擔的同時，在醫療經濟面上亦甚理想。圖式簡單說明
    【第1圖】表示EGFR的IHC分數及症例數。
    【第2圖】表示EGFR的IHC分數及EGFR mRNA的表現量(EGFR/ACTB,log2變換值)。
    【第3圖】表示EGFR高表現群及低表現群之Kaplan-Meier存活曲線。
    【第4圖】表示SC-4胃癌細胞株之IHC法之圖像(EGFR陽性細胞[箭號處]，x400)。
    【第5圖】表示從SC-4胃癌細胞株得到的每天腫瘤體積變化的圖。
    【第6圖】表示最終效果判定日Day15之RTV的圖及依據IUT步驟所得之IUT檢定結果。
    【第7圖】表示SC-2胃癌細胞株之IHC法之圖像(EGFR陽性細胞[箭號處]，x400)。
    【第8圖】表示從SC-2胃癌細胞株得到的每天腫瘤體積變化的圖。
    【第9圖】表示最終效果判定日Day15之RTV的圖及依據IUT步驟所得之IUT檢定結果。用以實施發明之形態 (1)本發明的預測方法
    本發明的預測方法是以該患者的EGFR表現量為基礎，以預測於胃癌患者使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法是否可顯示充份的治療效果。
    本發明的指標EGFR是貫穿細胞膜存在的酪胺酸激酶(tyrosine kinase)型的受體蛋白質，已知會傳遞表皮成長因子的訊息而控制細胞的增殖或生長。人類EGFR的鹼基序列及胺基酸序列在基因銀行(GenBank)中已登錄，其登錄編號分別為NM005228及NP005219，這些序列資訊可在本發明中利用。本發明中的人類EGFR鹼基序列及胺基酸序列，分別已顯示在序列編號1及序列編號2，可予以利用。
    本發明的對象患者是胃癌患者。本發明之「胃癌」雖包含除了原發性胃癌以外的局部再發的胃癌或轉移到其他組織(例如，淋巴結)的轉移性胃癌，但以原發性胃癌為宜。而且，此處所指的胃癌患者非只現有胃癌腫瘤組織的患者，也包含接受胃癌腫瘤組織切除的患者。
    本發明中的「替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑」意指替加氟、吉美嘧啶、奧替拉西鉀等3劑的複合劑。替加氟(tegafur，屬名，化學名：5-fluoro-1-(2-tetrahydrofuranyl)-2,4-(1H,3H)-pyrimidinedione)是眾所週知的化合物，會釋放出在生物體內接受活性化而具抗腫瘤活性的本體5-氟尿嘧啶(5-Flurouracil)之藥品。替加氟可以遵從眾所週知的方法製造，例如：日本專利公告昭和49-10510號(特公昭49-10510號)記載的方法。
    又，吉美嘧啶(gismestat，屬名，化學名：2,4-dihydroxy-5-chloropyridine)也是眾所週知的化合物，本身不具抗腫瘤活性，但會抑制生物體內將5-氟尿嘧啶代謝成不活性化作用的物質，可增強抗腫瘤效果。
    又，奧替拉西鉀(osteracil potassium，屬名，化學名：monopotassium 1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxo-1,3,5-triazine-6-carboxylate)也是眾所週知的化合物，本身不具抗腫瘤活性，主要分佈於消化道，藉由抑制此部位5-氟尿嘧啶的活性化而抑制消化道障礙的物質。
    本發明中的「替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑」之各有效成份的比例，只要在各自複合目的之奏效範圍內，並無特別限制。例如，與日本專利第2614164號公報記載的眾所週知的複合劑相同的範圍即可：相對於1莫耳的替加氟，吉美嘧啶0.1~5莫耳左右為佳，或0.2~1.5莫耳左右為較佳；奧替拉西鉀0.1~5莫耳左右為佳，或0.2~2莫耳左右為較佳。以莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1為特佳。而且，有莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1的替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑，可購入「TS-1」(商品名，大鵬藥品工業)。
    本發明之「EGFR抑制劑」並未特別受限於抑制EGFR的表現或活性的藥劑，吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)等以EGFR為目標物的低分子化合物，西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)等抗EGFR抗體，針對EGFR之反股寡核苷酸(antisense oligonucleotide)、適配體(aptamer)等的任一個皆宜，其中以抗EGFR抗體為佳，西妥昔單抗(cetuximab)為特佳。
    西妥昔單抗(cetuximab)是能專一性地辨識EGFR之人類-老鼠嵌合單株抗體(chimeric monoclonal antibody)，藉由抑制EGFR的活化、二聚體形成，已知對於結腸直腸癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、胃癌等具有抑制腫瘤增殖的效果。而且，西妥昔單抗(cetuximab)可以眾所週知的方法製造，例如：日本專利公告平成06-051689號(特公平06-051689號)記載的方法。
    替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑為替加氟、吉美嘧啶、奧替拉西鉀及EGFR抑制劑的複合劑(含有複數的有效成份的製劑)以單一劑型製劑而成(一種劑型形態)，或上述的有效成份以單劑方式，製劑成複數的劑型(多種劑型形態)亦可。其中，將替加氟、吉美嘧啶及奧替拉西鉀以複合劑方式製劑，EGFR抑制劑以單劑方式製劑，以多劑型形態使用為佳。
    抗腫瘤劑的投與形態並無特別限制，可因應治療目的適當選擇，具體而言，可列舉口服劑(錠劑、膜衣錠劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑等)、注射劑、栓劑、貼劑、軟膏劑等。其中，替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑以口服劑形態為佳。每個抗腫瘤劑之各式各樣的投與形態都對應於其藥理學上的可容許的載體，通常可以眾所週知的方法調製。這樣的載體是在一般的藥劑被廣泛運用的物質，可列舉例如：賦形劑、結合劑、崩散劑、潤滑劑、稀釋劑、溶解輔助劑、懸濁劑、等張劑、酸鹼值調整劑、緩衝劑、安定劑、著色劑、矯味劑、矯臭劑等。
    本發明之「使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑的化學療法」意指至少投與替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法，但並非只有單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑的化學療法，還包含替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及其他抗腫瘤劑併用的化學療法。
    又，「替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑併用的化學療法」意指包含將替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑組合後投與的化學療法，較佳的是含有以莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1之替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與西妥昔單抗(cetuximab)組合後投與的化學療法。只要此併用效果存在，上述藥劑可同時投與亦可在不同日期及時間投與。
    本發明之「單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑的化學療法」之投與時程將依據患者的年齡、性別、病程、轉移之有無、治療歷程等條件做適當的選擇。例如：每天80 mg/m2(以體表面積換算替加氟的劑量)之替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑(莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1)，連日投與4週後，停藥2週，共計6週為1個治療週期。投與時程可以該治療週期一次或重複數個週期為範例。
    本發明之「替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑併用的化學療法」之投與時程將依據患者的年齡、性別、病程、轉移之有無、治療歷程等條件做適當的選擇。例如：每天80 mg/m2(以體表面積換算替加氟的劑量)之替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑(莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1)，連日投與4週後停藥2週；每週投與250mg/m2(以體表面積換算劑量)之西妥昔單抗(共6次)；共計6週為1個治療週期。投與時程可以該治療週期一次或重複數個週期為範例(但是，每個治療週期的首次投與西妥昔單抗的劑量為400mg/m2(以體表面積換算劑量))。
    本發明之化學療法，可做為在該化學療法後進行腫瘤切除手術前的術前輔助性化學療法，或腫瘤切除後使用此化學療法做為術後輔助性化學療法皆宜。
    本發明中的「治療效果」可以腫瘤縮小效果或存活期延長效果來評估，存活期可以整體存活期或無惡化存活期的中位數等表示之。「選擇替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑併用的化學療法可以有充分治療效果」是指具有超越單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑的化學療法的治療效果而言，「選擇使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑的化學療法可以有充分治療效果」是指具有超越使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑併用的化學療法的治療效果而言。
    本發明的預測方法包含後述的步驟(1)~(3)。
    步驟(1)是測定在由採取自該患者所採取之活體試料中所含有之EGFR的之表現量的步驟。
    活體試料是指只要是採取自癌症患者之含有癌細胞的試料，並無特別限制，可列舉如：體液(血液、尿等)、組織、其抽出物及採取組織的培養物等。又，活體試料的採取方法，可因應活體試料的種類適當地選擇。
    本發明中的EGFR表現量是指mRNA表現量或蛋白質表現量皆可，但由測定的簡便性等之觀點而言，以蛋白質表現量為宜。
    本發明的測定方法，只要能定量mRNA或蛋白質含量的測定方法即可，並無特別限制，亦可使用眾所週知的測定方法。這樣的測定方法，在測定mRNA含量時可列舉如：聚合酶連鎖反應法(PCR法)、反轉錄-聚合酶連鎖反應法(RT-PCR法)、北方墨點法(Northern blot法)、螢光原位雜交法(FISF法)、微陣列法(microarray法)等，在測定蛋白質含量時可列舉如：西方墨點法(Western blot法)、免疫組織化學染色法(IHC法)等。其中，以簡便性的觀點而言，IHC法為佳。IHC法是使用抗EGFR抗體，在以腫瘤細胞的染色強度及陽性佔有率為基礎，分成0~3+的4階之分數化的評估法，是慣用的測定方法(Cancer 2001,92(5)：1331-46；Lung Cancer 2010,68(3)：375-82)。
    活體試料宜因應其測量定方法，以適當的處理方法調製之。又，測定時使用之含有引子(primer)、探針(probe)或抗體的試藥，與本發明相關的試藥之使用可於後敘述。
    步驟(2)是將由上述步驟(1)所得到之EGFR表現量與預先設定之對應切斷點(cut off point)相比較之步驟。
    切斷點可由預先設定之EGFR表現量經由各種統計分析方法求得。這樣的切斷點，可以特定於下列的任一數值：1.胃癌患者之EGFR表現量的平均值或中位數；2.胃癌患者之EGFR表現量與所定的治療效果之關係所得之敏感度及專一性之和，可列舉以ROC分析為基礎求得最大的值。在此，ROC分析(接收者操作特徵，receiver operating characteristic)是臨床檢查診斷中常用的求得敏感度及專一性的和最大值的閥值的分析方法。
    更具體地來說，如下列實施例詳細描述的一樣，以上述的切斷點計算法為基礎，例如：以IHC法測定EGFR蛋白質的表現量時，EGFR的切斷點以0~2+為佳，以1+為特佳。
    步驟(3)是針對上述步驟(2)之比較結果，進行預測步驟，若EGFR之表現量是比該切斷點更為高時，即預測：對該患者選擇併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法會上顯示出充分之治療效果的的可能性是高的；而若EGFR之表現量是在該切斷點以下時，則預測：對該患者選擇單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法會上顯示出充分之治療效果的可能性是高的。 (2)本發明的試藥
    本發明的試藥是使用於上述的本發明的預測方法的試藥，含有能專一地與EGFR的mRNA雜交的引子或探針，或能專一地辨認EGFR的蛋白質的抗體。
    本發明的引子或探針為能與序列編號1所示之鹼基序列內至少15個鹼基長的連續鹼基序列專一地雜交之含有15個鹼基長以上的鹼基序列的多核苷酸所形成的引子或探針。這樣的引子或探針之序列長為15個鹼基長以上，但只要能專一地和EGFR的mRNA雜交的話，並無特別的限制。
    這裏所稱的專一地雜交是指在嚴苛的雜交條件下，形成專一的雜交，非專一的雜交無法形成。嚴苛的雜交條件可以依據常法形成雜交的核酸的熔融溫度為基礎來決定。可維持具體的雜交狀態的洗淨條件通常是「1×SSC、0.1% SDS、37℃」程度的條件，可列舉較嚴格的為「0.5×SSC、0.1% SDS、42℃」程度的條件，更嚴格的為「0.1×SSC、0.1% SDS、65℃」程度的條件。
    另外，多核苷酸以含有相對於序列編號1所示之鹼基序列的至少15個鹼基長的連續鹼基序列之互補的鹼基序列為宜，但只要可能形成上述的專一的雜交，則完全的互補並非必要。這樣的多核苷酸以序列編號1所示之鹼基序列之連續的至少15個鹼基以上的鹼基序列所形成的多核苷酸，且與其互補的多核苷酸比較，其鹼基序列的一致性宜在70%以上，以80%以上為佳、以90%以上為較佳、以95%以上為更佳、以98%以上為特佳。在此，鹼基序列的一致性可用一致性檢索、序列排比程式、基本局部序列排比搜索工具(BLAST,basic local alignment search tool)、FASTA、ClustalW等計算之。
    而且，這些多核苷酸以序列編號1所示之鹼基序列之全鹼基序列長為基礎，例如可以市售的核苷酸合成機依據常法製作之。又，亦可以序列編號1所示之鹼基序列之全鹼基序列長為模板，用PCR法調製之。
    本發明的抗體，只要能辨識依據序列編號2所示的胺基酸序列所形成的多胜肽的抗體，並無特別的限制。單株抗體或多株抗體的任一種皆可，含有Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv及CDR的多胜肽等之抗體片段亦可。又，抗體為以序列編號2所示的胺基酸序列所形成的多胜肽為免疫抗原而調製成的抗體亦可；又，以序列編號2所示的胺基酸序列所形成的多胜肽，其構成的胺基酸序列之內至少要有連續的8個胺基酸、以15個胺基酸為佳、以20個胺基酸為較佳，只要針對形成的多胜肽具有抗原結合性的抗體亦可。這樣的多胜肽，可以序列編號2所示的胺基酸序列或由此胺基酸序列對應遺傳密碼得到鹼基序列為基礎，通常可以眾所週知的方法合成之。例如可列舉：胺基酸合成機所用的化學的合成方法，或基因工程的方法。
    本發明相關的抗體可遵循常法以製造之(例如：Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987),Publish John Wiley and Sons,Section 11.12-11.13)。例如，多株抗體的話可由此取得：遵循常法使用從大腸桿菌發現並精製的上述的多胜肽；或者遵循常法使用這些具有部分胺基酸序列的合成多胜肽，令實驗動物產生免疫，再由該免疫動物的血清遵照常法取得。另一方面，例如，單株抗體的話可由此取得：遵循常法使用從大腸桿菌發現並精製的上述的多胜肽；或者遵循常法使用這些具有部分胺基酸序列的合成多胜肽，令實驗動物產生免疫，由該實驗動物取得脾臟細胞及骨髓細胞，令其融合而合成融合瘤(hybridoma)細胞，再由該細胞中取得。 [實施例]
    以下，以本發明之實施例為基礎作更詳細的說明，但並不是意指本發明只限定於這些實施例。 [實施例1]胃癌患者的EGFR表現量
    癌症分期2~3期(Stage II~III)的胃癌患者(1059例)，切斷除胃癌腫瘤組織後，分成單獨使用手術組及TS-1治療組。針對TS-1治療組，每天投與TS-1 80~120 mg/day(換算替加氟的劑量，體表面積未滿1.25m2：80mg/day；1.25m2以上且未滿1.5m2：100mg/day；1.5m2以上：120mg/day)，連日投與4週後，停藥2週，共計6週為1個治療週期。該治療週期在術後1年間反覆實施。
    全部症例中有753例得以自手術摘出的胃癌腫瘤組織作成以福馬林固定、以parafilm封口膜包埋的病理標本。將parafilm封口膜包埋的病理標本藉由IHC法可測定EGFR蛋白質的表現量，藉由TaqMan PCR法可測定EGFR mRNA的表現量。第1圖表示EGFR的IHC分數及症例數，第2圖表示EGFR的IHC分數及EGFR mRNA的表現量(EGFR/ACTB,log2變換值)。
    其次，以EGFR的IHC分數(0，1+，2+，3+)為基礎，以1+為切斷點，則可分為EGFR低表現群(0，1+)526例，EGFR高表現群(2+，3+)227例。使用各群之整體存活期以實施存活期分析。第3圖表示EGFR高表現群及低表現群之Kaplan-Meier存活曲線。
    針對EGFR高表現群及低表現群之整體存活期，進行Log-Rank檢定，其P值為0.0142，為有統計意義的差異。以Cox風險模型(Cox hazard model)之單變數分析顯示EGFR高表現組與低表現組的風險比(hazard比)是1.37，EGFR高表現群比低表現群顯示有統計意義地預後不良。調整性別、年齡、Stage、TMN分類後，進行多變數分也顯示，EGFR是獨立的預後不良因子。而且，和EGFR高表現群及低表現群無關，TS-1治療組和單獨手術組比較，無論是整體存活期或無惡化存活期皆有統計意義的延長。
    由上述得知，與EGFR的表現無關，針對胃癌患者使用TS-1之化學療法，臨床上是有效果的，特別是對EGFR低下的胃癌症例，可獲得非常優良的治療效果，在此得到證明。 [實施例2]
    其次，為求檢驗使用於胃癌患者之新穎併用化學療法的有用性，所以實施了人類胃癌株及裸鼠皮下移植系統之活體內(in vivo)效力實驗。人類胃癌衍生SC-4腫瘤遵從常法移植至裸鼠皮下，TS-1以10mg/kg/day且以公比1.2的3種用量的投與量(10,8.3,6.9)，自第1天到第14天為止(Day 1~14)，每天經口投與。西妥昔單抗(cetuximab)以20mg/kg的投與量，在第1、4、8及11天(Day 1,4,8,11)進行腹腔內投與。又，兩藥劑之併用，以與單劑相同的投與量、投與路徑、投與日程表進行之。每天以電子卡尺測量腫瘤的長徑及短徑，由此計算出腫瘤的體積；同時測量體重以作為副作用的指標。相對於未投與藥劑之對照組的腫瘤體積，計算投與藥劑組的腫瘤體積的縮小百分比(腫瘤體積增加比率[Relative Tumor Volume，RTV])，就是活體效力。
    關於人類胃癌衍生SC-4腫瘤的EGFR表現程度，以Taq Man PC法測定實施後，其值為1.66(EGFR/ACTB，log2變換值)，IHC分數為2+以上，確認是相當於EGFR高表現株。又，以免疫組織化學染色法(IHC法)測定SC-4之EGFR蛋白質的表現量。IHC法的測定：將卡諾固定液(Carnoy fixative)固定且以parafilm封口膜包埋的SC-4薄切切片之parafilm封口膜脫去後，使用Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution以阻止內生性過氧化酶(peroxidase)之作用；第一次抗體反應(抗人類EGFR之老鼠單株抗體[Clone No.2-18C9,Dako公司製])後，使用聚合物(polymer)試藥(LABBELED POLYMER-HRP,Dako公司製)以進行第二次抗體反應，藉由發色基質(33'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride+CHROMOGEN,Dako公司製)進行發色。結果如第4圖所示。使IHC法亦確認SC-4是IHC分數為2+以上，相當於EGFR高表現株。
    單獨投與的腫瘤增生抑制效果：TS-1 10mg/kg/day為39%、單獨投與西妥昔單抗(cetuximab)為21%；相對於此，可確認兩者併用之抑制效果可增強到48%。又，針對單劑的效力及併用的效力，以Intersection-Union Test步驟進行統計學的檢定，確認其為有統計意義的差別。同樣地，投與TS-1 6.9mg/kg/day為28%，西妥昔單抗(cetuximab)20mg/kg/day併用投與為36%，以IUT步驟分析確認併用效果為有統計意義的差別。關於以體重為副作用指標的檢討，西妥昔單抗(cetuximab)與TS-1的併用組之體重抑制在16%以下，處於十分容許的範圍內。第5圖顯示腫瘤體積每天的變化圖、第6圖顯示最終效果判定日Day15之RTV的圖及依據IUT步驟所得之各別的IUT檢定結果。 [實施例3]
    其次，宜確認SC-4胃癌細胞株得到的結果之再性，所以使用SC-2胃癌細胞株實施裸鼠皮下移植系統之活動體(in vivo)效力實驗。人類胃癌衍生SC-2腫瘤遵從常法移植至裸鼠皮下，TS-1以10mg/kg/day且以公比1.2的3種用量的投與量(10,8.3,6.9)，自第1天到第14天為止(Day 1~14)，每天經口投與。西妥昔單抗(cetuximab)以20mg/kg的投與量，在第1、4、8及11天(Day 1,4,8,11)進行腹腔內投與。又，兩藥劑之併用，以與單劑相同的投與量、投與路徑、投與日程表進行之。每天以電子卡尺測量腫瘤的長徑及短徑，由此計算出腫瘤的體積；同時測量體重以作為副作用的指標。相對於未投與藥劑之對照組的腫瘤體積，計算投與藥劑組的腫瘤體積的縮小百分比(腫瘤體積增加比率[Relative Tumor Volume，RTV])，就是活體效力。
    關於人類胃癌衍生SC-2腫瘤的EGFR表現程度，以Taq Man PC法測定實施後，其值為0.93(EGFR/ACTB，log2變換值)，IHC分數為2+以上，確認是相當於EGFR高表現株。又，與實施例2同樣地，以免疫組織化學染色法(IHC法)測定EGFR蛋白質的表現量，確認SC-2是IHC分數為2+以上，相當於EGFR高表現株(第7圖)。
    單獨投與的腫瘤增生抑制效果：TS-1 10mg/kg/day為25%、單獨投與西妥昔單抗(cetuximab)為20%；相對於此，可確認兩者併用之抑制效果可增強到36%。又，針對單劑的效力及併用的效力，以Intersection-Union Test步驟進行統計學的檢定，確認其為有統計意義的差別。關於以體重為副作用指標的檢討，西妥昔單抗(cetuximab)與TS-1的併用組之體重抑制在8%以下，處於十分容許的範圍內。圖8顯示腫瘤體積每天的變化圖、圖9顯示最終效果判定日Day15之RTV的圖及依據IUT步驟所得之各別的IUT檢定結果。
    在EGFR呈高表現之SC-2及SC-4中，可看出具統計意義之併用效果，由此顯示，對於EGFR高表現之胃癌患者而言，併用TS-1與西妥昔單抗之化學療法是有用的。
    由以上的結果可知，對胃癌患者而言，使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法，EGFR為預後不良的因子。並且，藉由確認西妥昔單抗(cetuximab)與TS-1的併用效果對EGFR高表現的胃癌細胞株具有統計意義上的差別，表示使用EGFR為生物標記(biomarker)之含有替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑的胃癌個別療法成為可能的事情。
    【第1圖】表示EGFR的IHC分數及症例數。
    【第2圖】表示EGFR的IHC分數及EGFR mRNA的表現量(EGFR/ACTB,log2變換值)。
    【第3圖】表示EGFR高表現群及低表現群之Kaplan-Meier存活曲線。
    【第4圖】表示SC-4胃癌細胞株之IHC法之圖像(EGFR陽性細胞[箭號處]，x400)。
    【第5圖】表示從SC-4胃癌細胞株得到的每天腫瘤體積變化的圖。
    【第6圖】表示最終效果判定日Day15之RTV的圖及依據IUT步驟所得之IUT檢定結果。
    【第7圖】表示SC-2胃癌細胞株之IHC法之圖像(EGFR陽性細胞[箭號處]，x400)。
    【第8圖】表示從SC-2胃癌細胞株得到的每天腫瘤體積變化的圖。
    【第9圖】表示最終效果判定日Day15之RTV的圖及依據IUT步驟所得之IUT檢定結果。
    <110> 大鵬藥品工業股份有限公司
    <120> …對胃癌患者選擇由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑所構成之化學療法的方法
    <130> 201252TW
    <150> JP 2011-109599
    <151> 2011-5-16
    <160> 2
    <170> PatentIn版本3.4
    <210> 1
    <211> 5616
    <212> DNA
    <213> 智慧人
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    <221> CDS
    <222> (247)..(3879)
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    <212> PRT
    <213> 智慧人
    <400> 2
    权利要求:
    Claims (13)
    [1] 一種預測對胃癌患者使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法的治療效果之方法，包含有下述步驟(1)~(3)：(1)測定採取自該患者之活體試料中所含EGFR之表現量的步驟；(2)將上述步驟(1)所得到之EGFR表現量與預先設定之對應切斷點(cut off point)相比較之步驟；以及(3)預測步驟，其係針對上述步驟(2)之比較結果，若EGFR之表現量比該切斷點更高時，即預測：對該患者選擇併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高；而若EGFR之表現量在該切斷點以下時，則預測：對該患者選擇單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    [2] 如申請專利範圍第1項之方法，其中替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之各有效成分的莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1。
    [3] 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中EGFR抑制劑為西妥昔單抗(Cetuximab)。
    [4] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中化學療法為術後輔助化學療法。
    [5] 一種抗腫瘤劑，係由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑所構成者，其用於治療胃癌患者，且該胃癌患者已在如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法中被預測：併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    [6] 如申請專利範圍第5項之抗腫瘤劑，其中替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之各有效成分的莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1。
    [7] 如申請專利範圍第5或6項之抗腫瘤劑，其中EGFR抑制劑為西妥昔單抗(Cetuximab)。
    [8] 一種抗腫瘤劑，係由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑所構成者，其用於治療胃癌患者，且該患者已在如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法中被預測：單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    [9] 如申請專利範圍第8項之抗腫瘤劑，其中替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之各有效成分的莫耳比為替加氟：吉美嘧啶：奧替拉西鉀=1：0.4：1。
    [10] 一種胃癌之治療方法，其特徵在於，對於胃癌患者實施併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法，且該患者已利用如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法而被預測：併用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑與EGFR抑制劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    [11] 一種胃癌之治療方法，其特徵在於，對於胃癌患者實施單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法，且該患者已利用如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法而被預測：單獨使用替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑之化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    [12] 一種由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑及EGFR抑制劑所構成之抗腫瘤劑的用途，係用於對胃癌患者實施併用化學療法，且該患者已利用如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法而被預測：選擇該併用化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
    [13] 一種由替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀複合劑所構成之抗腫瘤劑的用途，係用於對胃癌患者實施單獨化學療法，且該患者已利用如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法而被預測：選擇該單獨化學療法會顯示出充分治療效果的可能性高。
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